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20198内部透码:淺談聚合酶鏈反應(PCR)技術及發展

時間:2018-03-01 來源:夸克官方

香港内部透码联系人 www.qubrv.com  PCR技術是由美國生物化學家凱利·穆利斯在1983年發明的,之后在1993年10月,他因這項發明獲得了諾貝爾化學獎的殊榮。是當代分子生物學最重要的發明之一。PCR采用了利用一種人工方法和反復相同程序,并利用一種特殊的酶——即DNA聚合酶來擴增特定的DNA片段。從而使DNA的復制能夠在細胞外得以實現。
    PCR用于擴增一小段已知的DNA片斷,可能是單個基因,或者僅僅是某個基因的一部分。與生物細胞中自然發生的DNA復制不同的是,通過使用PCR技術我們可以人為控制所復制的DNA片段,然而它只能復制很短的DNA片斷,通常不超過10kbp(千堿基對)。某些特定的方法可以擴增40kbp左右的片斷,但是這種大小與真核細胞的染色體DNA相比仍然是很少的。例如,人的體細胞DNA含有大約30億個堿基對。 目前應用的PCR反應需要幾個基本組成:DNA模板(template),含有需要擴增的DNA片斷;一對引物(primer),人工合成的單鏈DNA,引物與所要擴增的DNA片斷的起始和終止區域完全互補。在“黏合”時引物結合于DNA模板的起始和終止點,DNA聚合酶結合到這兩個位置,開始合成新的DNA鏈;DNA聚合酶(polymerase),復制需要擴增的區域;脫氧單核苷酸(dNTP),DNA分子的最基本組件;緩沖體系,提供適合聚合酶行使功能的化學環境。
  DNA聚合酶天然存在于生物體內,在細胞分裂前進行DNA的復制。當DNA開始復制時,解旋酶將雙股的DNA分開成兩個單股。DNA聚合酶便結合在兩DNA單股鏈上,生成互補鏈。然而在體外實驗中解旋酶無法正常作用,只能通過把雙鏈DNA加熱到96℃來使得雙鏈分離成為兩條單鏈。在這個溫度下,DNA聚合酶就會失活,因此在每個循環的加熱步驟后必須補充新的聚合酶。穆利斯的原始PCR反應需要大量時間和DNA聚合酶,并且在整個PCR反應中都需要人來照看。后來,由嗜熱細菌水生棲熱菌體內產生的DNA聚合酶改善了這種低效的PCR反應。這種嗜熱細菌生活在溫度達到50至80℃的溫泉中,因此它的DNA聚合酶具有耐熱性。在用于PCR反應時,并不會因為高溫而失活,所以不需要不斷加入新的聚合酶,PCR反應由此變得簡單并且可以由機器操作。最初的具有耐熱性的DNA聚合酶被稱為Taq,因為提取于水生棲熱菌(Thermus aquaticus)。Taq酶至今仍被被廣泛用于當前的PCR操作中。然而Taq酶的缺點是它缺少3'->5'校正外切酶活性,因此在復制DNA時有時會出錯,造成DNA序列突變,這使得它并不適合DNA的測序與生物克隆工作。從海底火山附近的古菌中獲得的Pwo和Pfu等酶均有校正機制,能夠大大降低PCR反應中的突變。現在市場上的PCR試劑盒中常常把taq酶與其他高精密度聚合酶組合使用,來確保PCR的反應效率和準確性。
        PCR 的基本過程類似于DNA 的天然復制, 過程被稱為熱循環,特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核昔酸引物。整個過程由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA 變性:模板或經PCR 擴增形成的DNA經加熱至94℃左右一定時間后,雙鏈之間氫鍵斷裂,雙股螺旋解鏈,變成兩條單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應做準備。?模板DNA與引物的退火(復性):DNA加熱變性成單鏈后,當溫度降至一定程度(55℃左右)時,引物即與模板DNA單鏈的互補序列配對結合,該步驟時間1-2分鐘。新技術的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度會高于熔點3~5℃,僅需時間5~10秒。?引物的延伸:在Taq DNA聚合酶的作用下,DNA模板上的引物以dNTP為原料,按A-T、C-G堿基配對與半保留復制原則,合成一條新的與模板DNA鏈互補的鏈。重復上述變性-退火-延伸的循環過程,每一循環獲得的“半保留復制鏈”都可成為下次循環的模板。通常,整個過程一般可持續20至40個循環,每完成一個循環需時2-4min,2-3h就能將靶核酸擴增放大幾百萬倍。
        如今PCR這項技術,被廣泛地運用在醫學和生物學的實驗室,例如克隆、考古、建立遺傳圖譜、診斷傳染病、基因復制以及親子鑒定。同時還衍生出了各種變體,如逆轉錄PCR和實時PCR等。現代醫學研究證明,人類疾病多數是直接或間接與基因有關,如腫瘤、糖尿病和心血管疾病等。通過使用PCR技術,我們不僅可以有效地分析病因,也可以在臨床癥狀出現之前預測病人發病的可能性,從而提前預防。這對有遺傳病史家庭的成員十分有幫助。對于微生物感染引發的疾?。ㄏ婦?,病毒,真菌,寄生蟲等),PCR的應用也十分廣泛。完成一次對病理樣本的檢測只需3至4小時,遠遠快于傳統的檢測方法。由于引物的設計是針對于病原體核酸的特征序列的,所以不會發生誤診。
        在醫學實驗診斷中我們經歷了生化和免疫診斷的發展過程,由于各類擴增技術的出現使我們進入了基因診斷的新時代并成就了現代意義基因診斷的崛起。這將改變以往對疾病的表型認識和表型診斷,從本質上認識疾病和診斷疾病。在各類擴增技術中, PCR 的地位尤為突出。目前,全世界利用 PCR 技術診斷感染性疾病每年達幾千萬人次,其費用早已大幅下降,說明 PCR 有著巨大的潛在市場。美國臨床檢驗標準化委員會于 1995 年頒布了關于感染性疾病分子診斷應用范圍、條件和質量控制細則等準則文件。而國際臨床化學學會于 1998 年又發布了關于分子擴增在臨床診斷中應用的質量評估基礎的文件并對 PCR 操作的各個環節進行了詳細論述。兩個權威性文件也都肯定了 PCR 技術在醫學檢驗方面的重要性?;蛘鋃峽贍芙且院蟮姆⒄狗較蠆⒆魑膊〉某9嬲鋃霞際?。 
        夸克公司自2000年以來致力于核酸類產品的研發,并于2005成功開發出《乙型肝炎病毒核酸熒光定量檢測及YMDD變異檢測試劑盒》并獲取國家食品藥品監督局審批注冊證書,當時被評為國家二類新藥。該產品采用了乙型肝炎病毒特異引物,利用核酸擴增、熒光標記探針,結合taqman MGB雙探針技術,對人血清及血漿中乙型肝炎病毒(HBV DNA)定量檢測,同時對YMDD M位點變異進行檢測??捎糜諏俅捕砸倚透窩椎母ㄖ鋃蝦涂共《疽┪锏牧菩Ч鄄?。該產品特點具有以下特點:一、單管雙檢同一次反應,可同時測出HBV DNA載量及YMDD變異情況,為醫院節約試劑成本及時間;二、閉管檢測  直接在反應管中對PCR擴增產物進行熒光數據采集和分析,不需開蓋檢測,不需要擴增后處理;三、結果判斷簡捷、明確  通過雙色熒光通道檢測所得Ct值可直接分辨出是否發生YMDD變異,可適用于ABI系列、lightcycler480、iCycler等多通道PCR儀。
                                                                              技術部    周 靜